酶聯(lián)免疫試劑盒：夾心ELISA

  酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)是一種分析生物化學技術(shù)，能夠檢測和量化可溶性物質(zhì)，例如肽、蛋白質(zhì)、抗體和激素。本文上海通蔚詳細為您介紹下夾心ELISA法。

  ELISA優(yōu)勢很多，可以有效處理大量的樣本。這些高度特異性和靈敏的檢測可以檢測出低至每毫升0.01納克的抗原或抗體濃度。在ELISA實驗過程中，抗原-抗體復(fù)合物被固定在固體表面上。酶與復(fù)合物中的一個分子共價連接，添加酶特異性底物會產(chǎn)生可量化的有色反應(yīng)產(chǎn)物。

  在進行ELISA實驗過程，選擇合適的ELISA類型非常重要，常見的ELISA類型有直接ELISA、間接ELISA、競爭ELISA和夾心ELISA法等。其中夾心ELISA法為檢測目標分析物提供了無與倫比的靈敏度和特異性。相關(guān)閱讀：《elisa試劑盒有哪幾種類型？elisa四類型圖解》

  夾心ELISA法

  直接夾心ELISA通過將抗原捕獲在兩種特異性抗體之間來檢測抗原。夾心法ELISA主要組成如下：

  1.微孔板：通常為96孔板，根據(jù)檢測結(jié)果具有高結(jié)合力或中等結(jié)合力。

  2.捕獲抗體：特定蛋白質(zhì)結(jié)合的單克隆、多克隆或重組抗體。

  3.包被緩沖液：通常使用碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液（pH9.6）或PBS（pH7.4）用于蛋白質(zhì)吸附。

  4.樣品和標準溶液：抗原或其他目標蛋白。ELISA的常見樣品類型是血清、血漿、細胞上清液、尿液、唾液、組織勻漿和腦脊液。

  5.封閉緩沖液：牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉或商業(yè)封閉溶液，以防止非特異性結(jié)合。

  6.檢測抗體：與捕獲抗體結(jié)合到目標抗原上的不同表位并且是酶偶聯(lián)的（例如辣根過氧化物酶，HRP）單克隆、多克隆或重組抗體。

  7.底物溶液：HRP的TMB（3,3'，5,5'-四甲基聯(lián)苯胺）或其他酶的合適底物。

  8.終止液：通常為1N硫酸（用于TMB）。

  9.洗滌緩沖液：含Tween-20（0.05%）的PBS或Tris緩沖鹽水(TBS)。

  10.移液器和吸頭：用于精確測量體積。

  11.平板讀取器：用于檢測吸光度或熒光。

  夾心ELISA法流程

  步驟1：涂覆板材

  首先用碳酸鹽/碳酸氫鹽緩沖液(pH9.6)中濃度為1-10μg/mL的捕獲抗體包被微量滴定板的孔。應(yīng)用抗體后，將微量滴定板在4°C下孵育過夜，使抗體吸附到孔中。

  第2步：阻斷

  去除包被溶液后，通過向每個孔中添加封閉緩沖液（例如PBS中的1%BSA）來封閉剩余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點。將板在室溫下孵育1-2小時或在4°C下孵育過夜，以防止非特異性結(jié)合。去除封閉緩沖液并用PBS清洗3-5次，以幫助去除任何未結(jié)合的封閉劑。這是降低后續(xù)步驟中非特異性結(jié)合可能性的關(guān)鍵。

  為什么要阻斷？包被ELISA板是一種被動結(jié)合過程，其中生物分子被固定在孔表面上。如果不進行封閉，抗原或檢測抗體可能會非特異性地與板結(jié)合，導(dǎo)致背景高和靈敏度低。封閉會使自由結(jié)合位點飽和，從而防止非特異性相互作用。使用比反應(yīng)體積（100μl）更高的封閉體積（200μl）可確保全面覆蓋。

  步驟3：添加樣品和標準品

  向每個孔中添加100μL稀釋樣品（例如血漿、血清或細胞裂解物）。確保樣品在稀釋或封閉緩沖液中適當稀釋，濃度在測定的預(yù)期動態(tài)范圍內(nèi)（通常在1-100ng/mL之間）。將板在37°C下孵育90分鐘或在4°C下孵育過夜。

  ELISA控制的重要性是什么？包括陽性和陰性對照對于驗證檢測的準確性至關(guān)重要。陽性對照可確認檢測工作正常，而陰性對照可提醒您注意假陽性或非特異性結(jié)合。

  步驟4：清洗

  在每個步驟之間，特別是在與樣品和抗體一起孵育后，用PBS清洗培養(yǎng)皿幾次以去除任何未結(jié)合的物質(zhì)。

  步驟5：添加檢測抗體

  每孔加入100μL（通常為0.1-1μg/mL）稀釋的偶聯(lián)檢測抗體，室溫孵育2小時。務(wù)必用PBS清洗板3-5次，以去除未結(jié)合的檢測抗體。

  步驟6：添加底物

  洗滌后，將酶底物加入到每個孔中。底物與檢測抗體偶聯(lián)的酶發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生可測量的顏色變化。例如，TMB通常與HRP一起使用，反應(yīng)15-30分鐘后加入硫酸終止。

  步驟7：讀取結(jié)果

  使用微孔板讀數(shù)儀在適當?shù)牟ㄩL（例如TMB為450nm）下測量每個孔的光密度。顏色變化的強度與樣品中抗原的濃度成正比，可以通過使用已知濃度的抗原標準品將其與標準曲線進行比較來量化（圖3）。

  實驗注意事項

  1.小心處理樣本：避免反復(fù)凍融，因為這會降解敏感蛋白質(zhì)并影響檢測結(jié)果。與樣本收集和處理的方法保持一致。

  2.使用前將所有試劑放置至室溫：進行ELISA時，務(wù)必將所有試劑放置至室溫，除非實驗方案明確規(guī)定不要這樣做。這將有助于確保結(jié)合動力學在測定之間保持一致，并將對溫度敏感的成分保持在溶液中。

  3.嫻熟移液技術(shù)：最佳實踐建議包括選擇適合要添加的體積的移液器、以一定角度握住移液器尖頭分配液體且不接觸孔底，并始終在不同的樣品或標準之間更換移液器尖頭以避免交叉污染。

  4.遵守方案：為了獲得可重復(fù)的結(jié)果，遵守方案至關(guān)重要，無論是試劑盒提供的方案還是內(nèi)部方法。這包括與樣品制備方式保持一致，始終使用優(yōu)化的檢測條件，并遵守孵育時間和溫度。一般來說，建議孵育時間每小時的差異不超過+/-5分鐘。

  5.結(jié)合對照和參考標準：對照用于數(shù)據(jù)分析和驗證檢測性能。建議將對照放置在能夠突顯任何板漂移的位置（例如，96孔板的第1列和第12列通常用作對照孔，陽性對照位于A1-D1和E12-H12孔中，陰性對照位于E1-H1和A12-D12孔中）。

  解決常見問題

  1：高背景信號

  可能的原因：由于阻斷不充分導(dǎo)致非特異性結(jié)合。

  解決方法：增加封堵劑濃度或延長封堵時間。

  2：信號低或無信號

  可能的原因：目標蛋白或抗體的涂層不足。

  解決方案：確保適當?shù)耐繉訚舛炔⒘舫鲎銐虻姆跤龝r間。

  3：結(jié)果不一致

  可能的原因：樣品處理或培養(yǎng)時間的變化。

  解決方案：標準化樣品處理程序，嚴格遵守所有步驟的時間安排。

  4：井間變異性高

  可能的原因：移液不均勻或孔填充不一致。

  解決方案：使用校準的移液器，并確保在分配前徹底混合溶液。

  上述通蔚為大家介紹ELISA檢測方法，夾心ELISA法在科研領(lǐng)域應(yīng)用比較廣泛，了解夾心ELISA法及步驟，可以使用夾心ELISA獲得可靠、可重復(fù)的結(jié)果。