哪種 ELISA 技術(shù)適合您科研？一文為您解析

  酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 ( ELISA ) 由 Engvall 和 Perlmann (1971)首次提出，最初用于檢測(cè)免疫球蛋白 G。這種免疫測(cè)定是對(duì)當(dāng)時(shí)常見的放射免疫測(cè)定的一個(gè)可喜的變化，后者利用放射性標(biāo)記的抗體和抗原。ELISA 的發(fā)展基于 20 世紀(jì) 60 年代的觀察，即抗體或抗原可以吸附到固體表面并仍然參與高親和力結(jié)合。術(shù)語 ELISA 現(xiàn)在指的是多種免疫測(cè)定法，其中一些不涉及酶促反應(yīng)。然而，所有 ELISA 的共同點(diǎn)是使用抗體，抗體在確定測(cè)定的靈敏度和特異性方面發(fā)揮著重要作用。

  ELISA 用于生物醫(yī)學(xué)研究和發(fā)現(xiàn)的多個(gè)領(lǐng)域以及診斷目的。進(jìn)行 ELISA 的方法有很多種，確定哪一種方法最適合解決您的特定研究問題取決于多種因素，包括所需的靈敏度或檢測(cè)的具體內(nèi)容。在這里，上海通蔚生物描述了不同類型的 ELISA，重點(diǎn)介紹每種類型的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，以及選擇 ELISA 技術(shù)之前應(yīng)考慮的事項(xiàng)。

  有哪些類型的 ELISA？

  有四種 ELISA 技術(shù)可應(yīng)用于您的研究。選擇合適的抗體取決于可用的抗體、所需的結(jié)果以及樣品的復(fù)雜性。ELISA 技術(shù)包括：直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競(jìng)爭(zhēng)或抑制 ELISA。

  直接ELISA

圖 1 展示了直接 ELISA 的典型設(shè)置。通常，抗原被固定至多孔板。然后通過直接與辣根過氧化物酶 (HRP) 等酶綴合的抗體檢測(cè)抗原。

圖1 直接elisa

  優(yōu)點(diǎn)：

  1. 由于所需步驟較少，因此比其他 ELISA 技術(shù)快得多。

  2. 由于所需試劑和步驟較少，因此測(cè)定不易出錯(cuò)。

  缺點(diǎn)：

  1. 由于固定抗原的方法不具有特異性，這可能會(huì)導(dǎo)致比間接 ELISA 更高的背景噪音（如下所述）。這主要是因?yàn)闃悠分械乃械鞍踪|(zhì)（包括目標(biāo)蛋白質(zhì)）都會(huì)與板結(jié)合。

  2. 靈活性較差，因?yàn)槊糠N靶蛋白都需要特定的綴合一抗。

  3. 無信號(hào)放大，降低了測(cè)定靈敏度。

  直接ELISA應(yīng)用范圍：

  當(dāng)需要分析針對(duì)抗原的免疫反應(yīng)時(shí)，通常使用直接 ELISA 技術(shù)。

  間接ELISA

在該 ELISA 技術(shù)中，分兩步檢測(cè)固定在多孔板上的抗原。首先，未標(biāo)記的一抗（通常是單克?。┙Y(jié)合特定抗原。其次，應(yīng)用針對(duì)一抗宿主物種的酶聯(lián)二抗（通常是多克隆）。

圖2 間接elisa

  優(yōu)點(diǎn)：

  1. 靈敏度高，因?yàn)槎鄠€(gè)標(biāo)記的二抗可以結(jié)合一抗。

  2.經(jīng)濟(jì)，因?yàn)樾枰俚臉?biāo)記抗體。

  3. 具有靈活性，因?yàn)椴煌囊豢箍梢耘c單一標(biāo)記的二抗一起使用。

  缺點(diǎn)：

  1. 由于使用二抗而可能發(fā)生交叉反應(yīng)，這可能會(huì)增加背景噪音。

  2. 由于需要與二抗孵育步驟，因此比直接 ELISA 技術(shù)的程序更長(zhǎng)。

  間接ELISA應(yīng)用范圍:

  間接 ELISA 技術(shù)適用于測(cè)定樣品中的總抗體濃度。

  夾心ELISA

  夾心 ELISA 需要使用匹配的抗體對(duì)（捕獲抗體和檢測(cè)抗體）。因此，每種抗體對(duì)抗原的不同且不重疊的區(qū)域或表位具有特異性。重要的是，在 ELISA 中專門測(cè)試匹配的抗體對(duì)，以確保它們檢測(cè)到不同的表位，從而獲得準(zhǔn)確的結(jié)果。夾心 ELISA 的程序包括用捕獲抗體涂覆聚苯乙烯板。然后添加分析物或樣品，然后添加檢測(cè)抗體。檢測(cè)抗體可以是酶聯(lián)的，在這種情況下，這被稱為直接夾心 ELISA。如果使用的檢測(cè)抗體未標(biāo)記，則需要酶聯(lián)檢測(cè)二抗。這稱為間接夾心 ELISA。

單克隆和多克隆抗體均可用于夾心 ELISA。然而，多克隆抗體通常用作捕獲抗體，以盡可能捕獲最大量的抗原。

圖3 夾心elisa

  優(yōu)點(diǎn)：

  1、靈敏度高；其靈敏度比直接或間接 ELISA 高 2-5 倍。

  2.使用兩種抗體，特異性高。

  3. 提供靈活性，因?yàn)榭梢允褂弥苯雍烷g接方法。

  缺點(diǎn)：

  如果不使用標(biāo)準(zhǔn)化 ELISA 試劑盒或經(jīng)過測(cè)試的抗體對(duì)，抗體優(yōu)化可能會(huì)很困難，因?yàn)闇p少捕獲抗體和檢測(cè)抗體之間的交叉反應(yīng)非常重要。

  夾心ELISA應(yīng)用范圍：

  夾心 ELISA特別適合分析復(fù)雜樣品，因?yàn)樵谑褂眠@種方法進(jìn)行測(cè)量之前不需要純化抗原。

  競(jìng)爭(zhēng)/抑制 ELISA

競(jìng)爭(zhēng)/抑制 ELISA，也稱為封閉 ELISA，可能是所有 ELISA 技術(shù)中最復(fù)雜的。然而，上述每種測(cè)定類型都可以適應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)形式。競(jìng)爭(zhēng)/抑制 ELISA 主要用于通過檢測(cè)預(yù)期信號(hào)輸出中的干擾來測(cè)量樣品中抗原或抗體的濃度。本質(zhì)上，樣品抗原或抗體與參考分別競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合有限量的標(biāo)記抗體或抗原。樣品抗原濃度越高，輸出信號(hào)越弱，表明信號(hào)輸出與樣品中抗原的量成反比。

圖4 競(jìng)爭(zhēng)ELISA

  圖 4 顯示了基于直接檢測(cè)方法的競(jìng)爭(zhēng) ELISA 測(cè)試抗原的示例。在此示例中，使用已知抗原包被多孔板。按照標(biāo)準(zhǔn)封閉和洗滌步驟，添加含有未知抗原的樣品。然后使用標(biāo)記的檢測(cè)抗體使用相關(guān)底物（例如3,3',5,5'-四甲基聯(lián)苯胺或TMB）進(jìn)行檢測(cè)。如果樣品中抗原濃度高，則會(huì)觀察到信號(hào)輸出顯著減少。相反，如果樣品中的抗原非常少，則預(yù)期信號(hào)輸出將幾乎沒有減少。在圖 4 所示的示例中，信號(hào)輸出將會(huì)減少。

  優(yōu)點(diǎn)：

  1. 競(jìng)爭(zhēng)性ELISA的主要優(yōu)點(diǎn)是無需樣品處理，可以使用粗制或不純的樣品。

  2. 與夾心 ELISA 相比，對(duì)樣品稀釋和樣品基質(zhì)效應(yīng)的敏感性較低。

  3. 重復(fù)樣品之間和測(cè)定之間的變異性較小。

  4. 實(shí)驗(yàn)設(shè)置具有最大的靈活性，因?yàn)樗梢曰谥苯?、間接或夾心 ELISA。

  缺點(diǎn)：

  由于每種 ELISA 技術(shù)都可以適應(yīng)競(jìng)爭(zhēng)性形式，因此上述每種 ELISA 技術(shù)所描述的相同限制將適用于相應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)性/抑制 ELISA 技術(shù)。

  當(dāng)只有一種抗體可用于感興趣的抗原時(shí)，通常使用競(jìng)爭(zhēng)/抑制 ELISA 技術(shù)。它還適用于檢測(cè)不能被兩種不同抗體結(jié)合的小抗原，例如夾心 ELISA 技術(shù)。

  選擇合適的 ELISA 技術(shù)時(shí)要考慮的事項(xiàng)

  如上所述，有許多因素決定哪種 ELISA 技術(shù)適合解決您的研究問題。在決定哪一個(gè)適合您之前需要考慮以下幾個(gè)問題:

  您需要檢測(cè)什么？

  例如，如果檢測(cè)具有多個(gè)表位的大蛋白（例如細(xì)胞因子），則夾心 ELISA 將是最合適的。然而，如果檢測(cè)到半抗原等小分子，那么在這種情況下競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA 會(huì)更合適。

  有哪些試劑可用于您感興趣的抗原或抗體

  如果只有一種抗體可用于感興趣的抗原，則可以應(yīng)用直接或競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA。

  您想測(cè)量免疫反應(yīng)或分析物嗎？

  如果您需要檢測(cè)或定量分析物，則可以使用夾心法或競(jìng)爭(zhēng)性 ELISA。然而，如果您需要測(cè)量免疫反應(yīng)，那么直接或間接 ELISA 最適合您的需求。