【通蔚生物】: 蛋白濃度測(cè)定和操作說明

蛋白濃度檢測(cè)是一個(gè)實(shí)驗(yàn)，是根據(jù)吸光值可以推算出蛋白濃度.堿性條件下，蛋白將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA試劑形成紫顏色的絡(luò)合物，測(cè)定其在562nm處的吸收值，并與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，即可計(jì)算待測(cè)蛋白的濃度。

操作說明
一. 微孔酶標(biāo)儀法
1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按50體積 BCA試劑A 加1體積 BCA試劑B（50:1）配制成 BCA工作液，充分混勻 (混合時(shí)可能會(huì)有渾濁，但混勻后就會(huì)消失)。BCA 工作液室溫 24 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
2. 稀釋標(biāo)準(zhǔn)品：取 10μL BSA 標(biāo)準(zhǔn)品用 PBS 稀釋至 100μL（樣品一般可用 PBS 稀釋），使終濃度為 0.5mg/ml。將標(biāo)準(zhǔn)品按 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16, 20 μL加到 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加 PBS 補(bǔ)足至 20μL。
3. 將樣品作適當(dāng)稀釋（最好多做幾個(gè)梯度，如作 2 倍、4 倍、8 倍稀釋），加 20μL到 96 孔板的樣品孔中。由于移液器在取小量樣品時(shí)誤差偏大，標(biāo)準(zhǔn)線前面的點(diǎn)可能不很準(zhǔn)確，所以盡可能的讓樣品點(diǎn)落在標(biāo)準(zhǔn)線 1/2 后。
4. 各孔加入 200μL BCA 工作液，37℃放置 15-30 分鐘。用酶標(biāo)儀測(cè)定 A562nm，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度。使用溫箱孵育時(shí)，應(yīng)注意防止因水分蒸發(fā)影響檢測(cè)結(jié)果。

二. 蛋白濃度分光光度計(jì)法
如沒有酶標(biāo)儀，可用分光光度計(jì)在離心管中混勻后加入比色皿中比色。

蛋白濃度注意事項(xiàng)：
1. 長(zhǎng)期不用時(shí)，BCA試劑B與PBS 稀釋液可置于 2-8℃保存，如發(fā)現(xiàn)細(xì)菌污染則應(yīng)丟棄。BCA試劑A在低溫條件下出現(xiàn)結(jié)晶沉淀時(shí)，可 37℃溫育使其完全溶解, 不影響使用。
2. 樣品中若含有較多干擾物質(zhì)時(shí)，請(qǐng)采用 Bradford 蛋白濃度測(cè)定試劑盒。
3. 待測(cè)蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中，否者待測(cè)蛋白不蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測(cè)定不準(zhǔn)確。
4. 待測(cè)蛋白和蛋白標(biāo)準(zhǔn)加入 BCA 工作液后，如果發(fā)現(xiàn)檢測(cè)效果不佳，可以室溫放置 2h或 60℃放置 30min，顏色會(huì)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷加深。顯色反應(yīng)也會(huì)隨溫度升高而加快。如果濃度較低，可以適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間或在較高溫度下孵育。
5. 為了加快 BCA 法測(cè)定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱，但是切勿過熱，否則易失效。
6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。