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發(fā)布時(shí)間：2024-05-21 發(fā)布作者：上海通蔚生物
準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)定量是大多數(shù)蛋白質(zhì)研究中的關(guān)鍵步驟。研究生物分子之間的相互作用對(duì)于理解它們的功能非常重要。研究蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用是理解其功能的關(guān)鍵，并且在許多其他領(lǐng)域具有應(yīng)用，包括在藥物發(fā)現(xiàn)、開發(fā)等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。
本文的目的主要是介紹如何正確測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的關(guān)鍵方法和注意事項(xiàng)。蛋白質(zhì)濃度測(cè)定是蛋白質(zhì)研究的基礎(chǔ)，對(duì)其準(zhǔn)確性要求很高，并詳細(xì)介紹了不同測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)和注意事項(xiàng)。本文將重點(diǎn)介紹不同測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)，幫助您選擇最適合其研究的方案。
蛋白質(zhì)濃度定義為樣品中特定蛋白質(zhì)或一系列不同蛋白質(zhì)的總量或含量。
蛋白質(zhì)濃度測(cè)定在蛋白質(zhì)生物學(xué)和分子生物學(xué)中是必要且廣泛應(yīng)用的。蛋白質(zhì)定量分析涉及生產(chǎn)和科研的多個(gè)領(lǐng)域和行業(yè)，是生物學(xué)、食品檢驗(yàn)摻假、臨床檢驗(yàn)、疾病診斷、質(zhì)量檢驗(yàn)等領(lǐng)域最常用的方法。在分離、純化和分析之前必須計(jì)算蛋白質(zhì)樣品的濃度。
蛋白質(zhì)定量對(duì)于更好地了解樣品或配方產(chǎn)品中的總蛋白質(zhì)含量是必不可少的。這是涉及蛋白質(zhì)提取或分析的任何實(shí)驗(yàn)工作流程中的重要程序。精確的蛋白質(zhì)濃度是為后續(xù)實(shí)驗(yàn)生成可靠數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。
蛋白質(zhì)的定量方法有很多種，其中常見的有凱氏法、雙縮脲法、Lowry法、BCA法、Bradford法、紫外光吸收法(280nm)等六種。
蛋白質(zhì)濃度的測(cè)量主要基于兩個(gè)原則：一是利用蛋白質(zhì)的共同特征，如氮、肽鍵、折射率等，二是利用特定的氨基酸殘基，堿性或酸性蛋白質(zhì)中的基團(tuán)和芳香族基團(tuán)可測(cè)定蛋白質(zhì)含量。
凱氏定氮法由JohannKjeldahl于1883年發(fā)明。它包括消化、蒸餾和滴定三個(gè)步驟。在該方法中，用濃酸和催化劑消化蛋白質(zhì)后，總有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為硫酸銨。添加NaOH來中和沼渣并將銨轉(zhuǎn)化為氨。蒸餾出氨并收集在過量硼酸的接收瓶中以形成硼酸銨。通過使用合適的滴定技術(shù)滴定殘留的硼酸來測(cè)量樣品的總氮含量。需要使用轉(zhuǎn)換因子(F)將測(cè)得的氮濃度轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)含量。
比色測(cè)定方法基于響應(yīng)蛋白質(zhì)而在可見光譜中產(chǎn)生有色溶液。顏色變化與蛋白質(zhì)濃度成正比，并通過特定波長(zhǎng)下的吸光度測(cè)定來測(cè)量。通常，使用牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定蛋白質(zhì)含量。比色測(cè)定包括縮二脲試驗(yàn)、Lowry測(cè)定、二辛可寧酸(BCA)測(cè)定和考馬斯藍(lán)G-250染料結(jié)合(Bradford)測(cè)定。
雙縮脲試驗(yàn)，也稱為Piotrowski試驗(yàn)，是一種測(cè)定樣品中總蛋白質(zhì)的化學(xué)方法。由于蛋白質(zhì)分子中肽鍵（-CONH-）的結(jié)構(gòu)與縮二脲相似，因此蛋白質(zhì)在堿性溶液中也能與銅離子（Cu2+）反應(yīng)生成紫紅色化合物。
在縮二脲法中，Cu2+被蛋白質(zhì)內(nèi)的兩個(gè)肽鍵還原，然后螯合成紫色絡(luò)合物。產(chǎn)品的顏色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)濃度成正比，并通過540nm處的吸收光譜進(jìn)行測(cè)量。
后來，縮二脲試驗(yàn)經(jīng)過改進(jìn)，進(jìn)而發(fā)展為肽的兩種比色分析：Lowry測(cè)定法和BCA測(cè)定法。
Lowry測(cè)定法由OliverLowry于1951年首次提出[1]。在Lowry法中，肽鍵首先在堿性條件下將銅離子還原成亞銅離子。Folin-Ciocalteu試劑隨后與亞銅離子以及酪氨酸、色氨酸和半胱氨酸的側(cè)鏈反應(yīng)，產(chǎn)生一種深藍(lán)色復(fù)合物，稱為雜多鉬藍(lán)。雜多鉬藍(lán)的顏色強(qiáng)度與樣品中的蛋白質(zhì)含量呈正相關(guān)，通過660nm處的吸光度進(jìn)行測(cè)量。
BCA測(cè)定是在Lowry測(cè)定的基礎(chǔ)上改進(jìn)的。在BCA測(cè)定中，蛋白質(zhì)肽鍵螯合Cu2+離子，并在堿性條件下將其還原為亞銅離子(Cu+)[2]。Cu+離子與BCA反應(yīng)形成紫色絡(luò)合物，其顏色強(qiáng)度通過562nm處的吸光度測(cè)定來測(cè)量[2][3]。吸光度與蛋白質(zhì)濃度在很寬的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。
Bradford測(cè)定法最初由MarionM.Bradford于1976年開發(fā)[4]，是一種染料結(jié)合方法，基于考馬斯亮藍(lán)G-250染料-蛋白質(zhì)相互作用引起的顏色變化?？捡R斯G-250染料與蛋白質(zhì)上的可電離基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生變化并隨后暴露疏水袋[4][5]。該染料與疏水性氨基酸結(jié)合，形成穩(wěn)定的藍(lán)色復(fù)合物。藍(lán)色復(fù)合物的顏色強(qiáng)度可以通過595nm處的吸光光度測(cè)定法進(jìn)行測(cè)量。吸光度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系。
這是一種通過測(cè)量樣品在280nm處的紫外吸光度（A280）來直接測(cè)定蛋白質(zhì)濃度的方法。蛋白質(zhì)中的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸能吸收紫外光[6]，這些芳香族氨基酸的吸收峰在280nm波長(zhǎng)處，且吸收峰的光密度與它們的濃度成正比，因此可以作為蛋白質(zhì)定量測(cè)定的依據(jù)。由于各種蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸的含量不同，需要知道它們的消光系數(shù)（ε），作為準(zhǔn)確定量的參考。ε系數(shù)可以通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定，也可以根據(jù)氨基酸序列計(jì)算得出。
在ELISA中，目標(biāo)蛋白被酶標(biāo)記的特異性抗體捕獲，然后通過與其底物的酶反應(yīng)進(jìn)行定量。通過酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下測(cè)量所產(chǎn)生的復(fù)合物的光吸收。酶-底物反應(yīng)產(chǎn)生的顏色強(qiáng)度與樣品中的蛋白質(zhì)濃度成正比。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度?，F(xiàn)在市場(chǎng)上有各種優(yōu)質(zhì)的定量ELISA試劑盒，為特定蛋白的定量提供了更多的便利。
基于上述蛋白定量原理，各種蛋白檢測(cè)試劑盒也逐漸面世，主要包括BCA蛋白檢測(cè)試劑盒和Lowry蛋白檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)了蛋白濃度測(cè)定的簡(jiǎn)單、高穩(wěn)定性、高靈敏度和高兼容性。
當(dāng)測(cè)定樣品中的蛋白質(zhì)含量時(shí)，首先要考慮的是選擇合適的測(cè)量方法。由于可用的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法多種多樣，因此我們需要考慮許多因素，以確保所使用的檢測(cè)方法最適合應(yīng)用。每種測(cè)定都有其自身的優(yōu)點(diǎn)和局限性。由于沒有一種試劑可以被認(rèn)為是理想或最佳的蛋白質(zhì)測(cè)定方法，因此還可能需要獲得一種以上類型的蛋白質(zhì)測(cè)定用于研究應(yīng)用。
沒有單一的測(cè)定可以用來量化所有蛋白質(zhì)類型。因?yàn)樵谶x擇與樣品最相容的適當(dāng)方法之前，需要考慮某些方法的具體限制。為了確保測(cè)量數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，必須考慮幾個(gè)因素。
選擇合適的方法取決于樣品中蛋白質(zhì)的特性以及分析方法的特征。一般來說，選擇蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法需要考慮許多因素，包括樣品或裂解緩沖液中的干擾劑、測(cè)定靈敏度和樣品體積、樣品制備、分析速度、便利性和試劑的可用性、測(cè)定時(shí)間、蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、蛋白質(zhì)樣品的稀釋度、蛋白質(zhì)之間的變化、設(shè)備要求以及與待分析樣品的緩沖液成分的兼容性。
蛋白質(zhì)濃度的測(cè)量對(duì)于蛋白質(zhì)純化、電泳、細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和其他研究應(yīng)用是必要的。
紫外吸收法在蛋白質(zhì)、酶的生化制備中應(yīng)用十分廣泛，此方法適合配合色譜柱實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)的吸附或洗脫情況，但結(jié)果不太準(zhǔn)確。
Bradford方法適用于大規(guī)模樣品分析，但樣品中不應(yīng)含有高濃度的去污劑，這需要更嚴(yán)格的樣品標(biāo)準(zhǔn)。建議一般使用，特別是用于評(píng)估細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)含量和估計(jì)凝膠電泳的蛋白質(zhì)濃度。
Lowry方法用于測(cè)量酶分級(jí)過程中的蛋白質(zhì)、混合組織蛋白質(zhì)、測(cè)量極少量的蛋白質(zhì)或高度稀釋的蛋白質(zhì)以及分析大量相似的蛋白質(zhì)樣品。
標(biāo)準(zhǔn)BCA測(cè)定可用于確定每個(gè)均質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)濃度。
不同的蛋白質(zhì)定量方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，沒有一種方法能夠完美適用于所有實(shí)驗(yàn)。選擇合適的測(cè)定方法需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，權(quán)衡測(cè)定時(shí)間、靈敏度、準(zhǔn)確度等因素。希望這篇文章能幫助讀者更好地了解各種蛋白質(zhì)定量方法，并選擇最適合其研究需求的方法。
引用參考：
[1] Lowry OH, Rose Brough NJ, et al. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem. 1951 Nov;193(1):265-75.
[2] Gornall AG, Bardawill CJ, David MM. Determination of serum proteins by means of the biuret reaction. J Biol Chem. 1949;177:751–766.
[3] Smith PK, Krohn RI, et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 1985;150:76-85.
[4] M M Bradford. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding [J]. Anal Biochem. 1976 May 7; 72:248-54.
[5] Sedmak JJ, Grossberg SE. A rapid, sensitive, and versatile assay for protein using Coomassie brilliant blue G250. Anal Biochem. 1977;79:544–552.
[6] Simonian M. H. Spectrophotometric determination of protein concentration. In: Wrolstad R. E., editor. Handbook of Food Analytical Chemistry. New Jersey, NJ, USA: John Wiley & Sons; 2000. pp. 115 -121.
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