了解ELISA技術(shù)：如何用它來(lái)檢測(cè)免疫球蛋白

  通過(guò) ELISA，可以輕松檢測(cè)和定量溶液中的免疫球蛋白，無(wú)論您是在尋找抗原特異性 Ig 還是總 Ig，例如 IgG、IgA... 在本文中，將引導(dǎo)您完成不同的檢測(cè)設(shè)置，準(zhǔn)備您來(lái)解決您的具體研究問(wèn)題。關(guān)于LG，可以參考《什么是抗體》

  用抗體檢測(cè)抗體

  抗體是特異性結(jié)合靶分子的蛋白質(zhì)，因此是脊椎動(dòng)物免疫系統(tǒng)的核心參與者。在上個(gè)世紀(jì)，我們?nèi)祟?lèi)已經(jīng)學(xué)會(huì)利用其獨(dú)特的特性在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行應(yīng)用。最終，我們可以在測(cè)定中使用抗體來(lái)檢測(cè)其他抗體。

  圖 1. ELISA 中檢測(cè) IgG 的三種不同設(shè)置的測(cè)定原理?？乖禺愋?IgG 可以通過(guò) A) 間接或 B) 反向設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)，總 IgG 可以通過(guò) C) 夾心設(shè)置進(jìn)行檢測(cè)。這是 IgG 評(píng)估的示例；可以使用相應(yīng)的測(cè)定抗體對(duì)該測(cè)定進(jìn)行修改以檢測(cè)其他 Ig 同種型或亞類(lèi)。

  抗原特異性免疫球蛋白

  檢測(cè)抗原特異性免疫球蛋白的設(shè)置與經(jīng)典的夾心測(cè)定不同。最常見(jiàn)的方法是首先將抗原涂覆到板上（圖 1A）。或者，可以在反向設(shè)置中使用標(biāo)記抗原（圖 1B）。無(wú)論您選擇哪種設(shè)置，請(qǐng)記住，抗原特異性 ELISA 在很大程度上取決于抗原的天然形式或盡可能接近的形式。用于檢測(cè)的抗原通常是由研究人員自己重組產(chǎn)生的，但有些也可以從市場(chǎng)上購(gòu)買(mǎi)。

  抗原特異性 Ig ELISA 的典型設(shè)置（圖 2）包括以下步驟：

•   利用抗原與塑料的疏水性結(jié)合將感興趣的抗原涂覆在 ELISA 板上。我們建議使用高結(jié)合 ELISA 板，例如聚苯乙烯制成的 ELISA 板。

  如果您正在建立全新的檢測(cè)，請(qǐng)注意抗原上的相關(guān)表位可能在包被步驟后被隱藏。如果您懷疑隱藏表位是 ELISA 無(wú)效的原因，您可以嘗試不同的包被方案。例如，您可以測(cè)試不同的包被緩沖液，例如 PBS 7.4 或碳酸氫鹽緩沖液 pH 9.5，因?yàn)?pH 值會(huì)影響氨基酸側(cè)鏈和聚苯乙烯之間的疏水結(jié)合。或者，如果您有標(biāo)記格式的抗原，您可以測(cè)試反向 ELISA 設(shè)置（圖 1C）。

•   板涂覆之后是封閉步驟。

•   添加樣品后，抗原特異性免疫球蛋白應(yīng)與板上包被的抗原結(jié)合。

•   未結(jié)合的免疫球蛋白將在隨后的洗滌步驟中被洗掉。

•   使用對(duì)結(jié)合的免疫球蛋白的 Fc 部分具有特異性的抗體來(lái)檢測(cè)剩余的抗原特異性免疫球蛋白。這通常以同種型特異性方式進(jìn)行，例如僅 IgG 檢測(cè)。從更實(shí)際的角度來(lái)看，可以使用一步（圖 2A）或兩步檢測(cè)設(shè)置（圖 2B）。由于抗原特異性免疫球蛋白的豐度可能較低，因此更靈敏的兩步檢測(cè)可能更適合放大檢測(cè)信號(hào)。

  圖 2.抗原特異性免疫球蛋白 ELISA，使用 A)一步檢測(cè)的直接ELISA 或 B)兩步檢測(cè)的  間接ELISA。

  抗原特異性免疫球蛋白檢測(cè)的應(yīng)用

•   對(duì)疫苗、感染、自身抗原、過(guò)敏原等的免疫反應(yīng)！

•   雜交瘤篩選

  同型或亞類(lèi)特異性免疫球蛋白

  典型的夾心測(cè)定設(shè)置可用于檢測(cè)相同同種型（也稱(chēng)為類(lèi)）或相同抗體亞類(lèi)的抗體（圖 1C、圖 3）。為此，您需要一對(duì)特異于 Ig Fc 部分（抗體骨架）的匹配抗體對(duì)，以區(qū)分同種型或亞類(lèi)。將捕獲抗體包被到 ELISA 板后，樣品中的 Ig 將被特定包被 mAb 捕獲，然后在下一步中被檢測(cè)抗體夾在中間。由于 Ig 同種型通常在血液樣本中含量豐富，因此一步檢測(cè)設(shè)置（圖 3A）可能優(yōu)于兩步檢測(cè)（圖 3B），因?yàn)椴恍枰盘?hào)放大。IgE 是一個(gè)例外，由于其在人體中的豐度較低，因此應(yīng)使用兩步 ELISA 進(jìn)行分析。

  圖 3.使用 A) 一步檢測(cè)或 B) 兩步檢測(cè)，通過(guò)夾心 ELISA 檢測(cè)總免疫球蛋白同種型或亞類(lèi)。

  抗免疫球蛋白 ELISA 的應(yīng)用

•   量化樣品中的總免疫球蛋白水平

•   通過(guò)確定免疫球蛋白同種型和亞類(lèi)揭示免疫反應(yīng)的細(xì)節(jié)

  如何使用Ig ELISA？

  圖 4.抗原特異性 Ig ELISA 應(yīng)用示例。在加強(qiáng)注射之前和之后使用 ELISA 測(cè)量破傷風(fēng)類(lèi)毒素 (TT) 特異性 Ig。在接種 Covaxis（一種包含 TT 的聯(lián)合疫苗）加強(qiáng)劑量之前和之后兩周，收集了來(lái)自四位不同捐贈(zèng)者的血漿樣本。將血漿樣品稀釋 10,000 倍（IgG、IgM）、1,000 倍（IgG1）或 100 倍（IgG2、IgG3、IgG4），并使用同種型或亞類(lèi)特異性檢測(cè)抗體檢測(cè) TT 特異性 Ig 的結(jié)合。

提示！

  如果您在同一塊板上結(jié)合同種型檢測(cè)和抗原特異性檢測(cè)，請(qǐng)注意 ELISA 方案的差異。