ELISA檢測試劑盒：原理、步驟和操作指南

  elisa檢測試劑盒簡稱“酶聯(lián)免疫試劑盒”簡稱，它是繼免疫熒光和放射免疫技術之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術。1971年– PeterPerlman和EvaEngvall開發(fā)了一種革命性的方法，稱為ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）。ELISA技術自七十年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前廣泛生物學和醫(yī)學科學的許多領域。

  如今elisa檢測試劑盒具有 靈敏度、特異性、精密度、穩(wěn)定性、簡便性、安全性及經(jīng)濟性等受到科研好評。接下來上海通蔚帶大家詳細了解一下elisa實驗原理及步驟。

  ELISA原理

  酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）是一種使用酶標儀進行測定的免疫測定法，用于檢測和定量生物分子，例如抗體、蛋白質、激素或肽，以及表征蛋白質-蛋白質和蛋白質-核酸相互作用。

  在ELISA實驗中，用于實驗的靶標（如抗原）固定在固體表面上，然后使用辣根過氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）的酶綴合抗體進行檢測。通過與被酶催化的底物孵育來實現(xiàn)定量，從而產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。

  由于抗原、抗體的反應在一種固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進行，每加入一種試劑孵育后，可通過洗滌除去多余的游離反應物，從而保證試驗結果的特異性與穩(wěn)定性。在實際應用中，通過不同的設計，具體的方法步驟可有多種。目前，elisa試劑盒檢測方法有直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA 和競爭 ELISA 等。

  直接ELISA法

  在直接ELISA中，抗原通過被動吸附直接固定在板（聚苯乙烯微孔板上）的表面，然后使用蛋白質（例如抑肽酶、卵清蛋白、BSA或任何其他動物蛋白）封閉微孔板，洗滌板并與一抗一起孵育。并使用HRP標記的一抗進行檢測。將無色底物引入樣品，該底物與酶結合物反應，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。該副產(chǎn)物可以是比色的，化學發(fā)光的或熒光的。

圖1 直接ELISA

  由于elisa直接法步驟較少，適用于實驗室工作流程的快速技術，同時還消除了二抗交叉反應，其缺點是靈敏度較低，成本較高。

  間接ELISA法

  間接ELISA法是在直接ELISA上改進的版本。在間接ELISA中，用于檢測抗原的一抗是未偶聯(lián)的。間接ELISA工作流程要涉及到兩種類型抗體：一抗和二抗。取而代之的是，對一抗的宿主物種具有反應性的酶標二級抗體被用于檢測一抗-抗原復合物（間接檢測抗原）。將無色底物引入樣品，該底物與酶結合物反應，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色的，化學發(fā)光的或熒光的。

圖2 間接ELISA

  間接ELISA的優(yōu)點是成本較低、更加靈敏和靈活。然而，由于二抗的存在，檢測過程中存在交叉反應的可能性。

  夾心ELISA法

夾心elisa法也叫“三明治法”，它需要使用匹配的抗體對，從而每種抗體對抗原上不同的非重疊表位具有特異性。首先將一種抗體，稱為捕獲抗體，包被在多孔微量滴定板的表面上，以促進靶抗原的固定。然后，第二種抗體（稱為檢測抗體）與捕獲抗體-抗原復合物結合。最后，添加對檢測抗體（而非捕獲抗體）具有特異性的酶標記的第二抗體偶聯(lián)物。

圖3 夾心ELISA

  夾心ELISA具有最高的靈敏度，但其主要缺點是該過程所需的時間和費用。此外，尋找完美抗原抗體對的必要性也是該測定的限制。

  競爭ELISA法

  競爭elisa法檢測樣品中抗原特異性抗體的存在。將特異性抗體吸附于固相載體，加入待測抗原（標準品或樣本）和生物素標記的檢測抗原，二者競爭與固相抗體結合，然后加入辣根過氧化物酶標記的親和素，經(jīng)過溫育和徹底洗滌后加入顯色底物。顯色的深淺與樣品中待測物質含量呈負相關。

  競爭elisa法不能用于經(jīng)過任何程度稀釋的樣品，并且靈敏度較低。然而，它有許多優(yōu)點，例如需要較少的樣品純化、較小的變異性以及分析樣品中的一系列抗原。

  Elisa檢測試劑盒組成及選擇

  Elisa檢測試劑盒組成

  Elisa檢測試劑盒組成通常包含酶標板（Microplate）、標準品（Standard）、生物素標記的檢測抗體(DetectedAntibody)、洗滌液(WashingBuffer)、辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(HRP-Streptavidin)和顯色底物(TMB)。

圖4 elisa試劑盒組成

  Elisa檢測試劑盒選擇

  ELISA實驗的成敗，很大程度上取決于試劑盒的選擇。面對眾多品牌和種類，如何挑選合適的試劑盒呢？以下六個關鍵要素為你指明方向：

  1、供應種屬

  一個ELISA試劑盒，多個種屬，如果您需對不同物種的同一因子進行定量，建議優(yōu)先尋找適用于多個種屬的ELISA試劑盒，產(chǎn)品屬性說明中會注明。Elis試劑盒種屬有羊、雞、鴨、人、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠、兔子、豬、犬、猴、馬、牛等動物。

  2、明確樣本的類型

  首先，您需要確定要檢測的分析物的樣本的類型。夾心ELISA最適合檢測具有眾多表位的巨大蛋白質，例如細胞因子。而競爭性ELISA主要用于檢測小分子，例如半抗原。

  大多數(shù)市售ELISA試劑盒均已在培養(yǎng)物上清液和血清/血漿上進行了驗證。正確閱讀產(chǎn)品說明和說明非常重要。這確保了該試劑盒適合需要分析的樣品。

  血漿樣本的采集方式會極大地影響試劑盒類型的選擇，進而影響所獲得的結果。

  其他因素，例如溶血和樣品制備中存在的脂質，可能會影響測定性能。在選擇ELISA試劑盒之前，請確保充分注意這些因素。

  抗體類型

  您可以聯(lián)系ELISA試劑盒供應商，獲取有關試劑盒中使用的抗體類型的信息。它將幫助您確定它是單克隆抗體還是多克隆抗體。對于夾心ELISA，使用多克隆抗體捕獲抗體和使用單克隆抗體檢測抗體是有益的。

  線性和回收率實驗

  您可以進行回收率和線性實驗來監(jiān)測ELISA試劑盒的性能。回收率測試分析樣品基質中存在的變化對分析物檢測的影響。據(jù)觀察，如果該值較高，則恢復效果更好。

  稀釋線性分析特定稀釋劑中分析物的劑量響應線性。在理想情況下，所有稀釋度的樣品濃度都是相同的。

  很多時候，供應商在產(chǎn)品規(guī)格中給出了回收率和線性數(shù)據(jù)。除此之外，為了更清楚起見，還提到了其他關鍵參數(shù)，例如動態(tài)范圍和靈敏度。不同制造商提供的ELISA試劑盒可能具有不同的數(shù)據(jù)參數(shù)。要選擇合適的ELISA試劑盒，您可以分析所有數(shù)據(jù)參數(shù)，尤其是線性和回收率數(shù)據(jù)。

  系統(tǒng)所用檢測范圍

  ELISA中可用的各種檢測系統(tǒng)包括比色法、發(fā)光法和熒光法。所有ELISA試劑盒都包括一定水平的分析物阻塞，包括應用酶標記和類似底物。選擇合適的酶和相同的底物至關重要。此外，應謹慎選擇交叉反應的酶底物、檢測設備和微孔板。

  文獻引用數(shù)

  好的產(chǎn)品，肯定經(jīng)得起廣大科研工作者的檢驗，ELISA試劑盒文獻引用特別是高質量的SCI文章的引用是很多人都關心的問題，這是業(yè)界對產(chǎn)品認可的一個非常重要指標，而且對相關用戶的科研有一定的借鑒作用。

  Elisa檢測試劑盒基本步驟

  Elisa檢測試劑盒基本步驟分包被、溫育、洗滌和測量，詳細如下：

  包被酶標板。將酶標板（微孔板）的孔位用特定的抗體或抗原進行包被，以便后續(xù)的檢測。

  加樣。將標準品或待測樣品加入酶標板的孔中。這可能包括稀釋樣品和標準品。在加樣時，應避免觸及孔壁，并輕輕晃動混勻。

  溫育。用封板膜封閉酶標板后，將其放置在特定溫度下進行溫育，以便樣本與孔內的抗體或抗原充分反應。

  洗滌。溫育后，用洗滌液徹底清洗孔位，去除未結合的物質。

  加酶標記抗體。向孔中加入與待測物質結合的酶標記抗體，形成免疫復合物。

  再次洗滌。去除未結合的酶標記抗體。

  顯色和終止反應。加入底物溶液使酶標記抗體產(chǎn)生顯色或熒光反應。隨后加入停止液以停止反應。

  測量。使用酶標儀或熒光分析儀測量各孔的信號強度，根據(jù)信號強度確定待測物質的濃度。

  常用的ELISA檢測方法

  在ELISA中，經(jīng)常使用與特定抗原結合的標記抗體。因此，當將能夠轉化酶的底物添加到反應混合物中時，會引起溶液顏色的變化。使用檢測方法來檢測或分析信號。

  根據(jù)酶和底物的不同，ELISA檢測中的檢測方法差異很大。如今，還有許多ELISA試劑盒可讓您輕松進行ELISA測定。但是，它不包含執(zhí)行檢測所需的通用試劑，例如tween-20、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、封閉緩沖液、洗滌緩沖液等。

  目前有許多檢測方法可用于研究抗原抗體復合物之間的反應，例如比色法、熒光法、化學發(fā)光法和顯色法。然而，下面介紹了其中最常見的三種。

  化學發(fā)光分析

  該技術利用過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體，例如HRP和AP?；隰斆字Z的溶液用作形成反應產(chǎn)物的底物，發(fā)射光子，可以使用光度計讀取光子。

  與其他檢測方法相比，該技術具有超靈敏性，具有更寬的動態(tài)范圍，甚至可以檢測給定樣品中最少量的分析物。

  顯色測定

  顯色法是ELISA檢測方法中最常見的類型之一。它涉及使用辣根過氧化物酶(HRP-)或堿性磷酸酶(AP-)標記的抗體與顯色底物（例如四甲基聯(lián)苯胺(TMB)溶液）結合使用。

  該技術利用反應的吸光度來確定讀數(shù)，用于比較樣品或根據(jù)標準曲線檢測感興趣分子的濃度。

  熒光分析

  該技術將過氧化物酶偶聯(lián)的檢測抗體（例如HRP和AP）與暴露于某些光波長時發(fā)出熒光的熒光底物相結合。即使分析物濃度較高，信號也不會飽和，并提供更準確的結果。

  上述為大家介紹了elisa檢測試劑盒原理和步驟，具體操作步驟要結合自己的實驗需求和說明進行操作。由于ELISA方法具有敏感、快速、操作簡便的優(yōu)點，已經(jīng)廣泛用于檢測中，對于科研，了解和操作ELISA實驗是非常重要的。