分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)：掌握滅菌技術(shù)

  什么是滅菌？滅菌是指"殺死或完全除去所有生物體"，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中最重要的操作之一。在培養(yǎng)大腸桿菌或無菌培養(yǎng)細(xì)胞/組織之前，請檢查是否被培養(yǎng)的生物體以外的微生物（例如細(xì)菌、酵母、霉菌、支原體）污染以及細(xì)胞之間的污染（交叉污染）。使用的介質(zhì)、試劑和設(shè)備應(yīng)盡可能無菌。此外，從分子生物學(xué)的角度來看，滅菌預(yù)計(jì)具有使受污染的DNA和RNA變性和降解、以及使溶核酶失活的作用。通過滅菌殺死或除去微生物的狀態(tài)稱為“無菌”，維持這種狀態(tài)稱為無菌操作。

  

 
 滅菌方法大致可分為使用熱的方法和不使用熱的方法：

  最熟悉和可靠的方法是使用熱量。例如，使用電烤箱的干熱滅菌、用火焰加熱金屬等的火焰滅菌、以及使用高壓蒸汽的高壓滅菌器（高壓蒸汽滅菌）。

  RNase對試劑和設(shè)備的污染是涉及RNA的實(shí)驗(yàn)中的一個問題，因此需要提供無RNase的環(huán)境，這意味著RNase被完全失活并去除。干熱滅菌和火焰滅菌可以可靠地去除 RNase，但要小心，因?yàn)楦邏簻缇赡軙粝律倭?RNase。

  另一方面，使用膜過濾器過濾滅菌是不使用加熱而物理去除微生物的常用方法，但由于核酸和病毒會通過過濾器，因此必須小心。此外，作為超出實(shí)驗(yàn)室水平的方法，還有伽馬射線滅菌和氣體滅菌（環(huán)氧乙烷氣體），用于對一次性塑料器械和醫(yī)院進(jìn)行滅菌。

  本文對實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方法干熱滅菌、高壓滅菌、火焰滅菌、過濾滅菌進(jìn)行概述、特點(diǎn)及注意事項(xiàng)。

  干熱滅菌

  干熱滅菌是使用電烘箱的滅菌方法，推薦加熱條件為160-170℃120分鐘、170-180℃60分鐘、180-190℃30分鐘。為了徹底去除 RNase，加熱 2-3 小時是安全的。

  用于對玻璃、金屬儀器等可加熱至高溫的物品以及不宜與蒸汽接觸的物品進(jìn)行滅菌。瓶蓋通常不能干熱滅菌，但可以使用杜蘭瓶紅色瓶蓋。

  將移液器放入移液器罐中，用鋁箔包裹玻璃器皿、研缽、攪拌棒、抹刀等，然后放入烤箱中。此時，請務(wù)必將設(shè)備徹底干燥后再插入，以免出現(xiàn)水滴。另外，請確保在烤箱中留出足夠的空間，以便熱量均勻地施加到電器上。加熱器附近的金屬部件可能會比設(shè)定溫度更熱，因此請避免在附近放置棉塞等易燃物品。打開開關(guān)并測量箱體達(dá)到指定溫度后的時間。滅菌完成后，關(guān)閉加熱器并等待冰箱內(nèi)部充分冷卻后再取出物品。

  高壓滅菌器滅菌

  高壓滅菌器（高壓蒸汽滅菌器/高壓滅菌器）是一種結(jié)構(gòu)類似于巨大壓力鍋的設(shè)備，它可以通過施加壓力來提高水的沸點(diǎn)，并利用高溫蒸汽進(jìn)行熱處理。這種熱處理有時稱為高壓釜。水的沸點(diǎn)在1個大氣壓下為100°C，但在2個大氣壓下則變?yōu)榧s121°C。典型的高壓滅菌包括在121℃下熱處理15至20分鐘。

  使用它不需要特殊的資格或許可證，但由于它被歸類為小型壓力容器，因此請小心處理。

  可高壓滅菌的儀器和溶液在高達(dá) 130°C 的溫度下保持穩(wěn)定，并且可以受潮。主要用于對干熱滅菌溫度（160°C或更高）敏感的橡膠儀器、玻璃儀器、耐熱塑料儀器、金屬、耐高壓滅菌介質(zhì)以及不發(fā)生熱變性的試劑的滅菌。水溶液可以高壓滅菌，但有機(jī)溶劑不應(yīng)高壓滅菌。

  為防止高壓滅菌器內(nèi)部污染，建議用于廢物處理的高壓滅菌器與用于滅菌的高壓滅菌器分開安裝，即使使用相同的設(shè)備，廢物處理和滅菌也應(yīng)分開進(jìn)行。經(jīng)常清潔用于滅菌的高壓滅菌器，并且當(dāng)有液體可能溢出到滅菌室時務(wù)必進(jìn)行清潔。

  高壓滅菌器滅菌程序

  首先，加入自來水，直到瀝水板（底部有孔的圓盤）稍微浸沒。此時，如果添加超純水，電流就不容易流動，防干燒機(jī)制可能會被激活。將儀器和試劑從上方放入籃子中。將蓋子放在正確的位置并擰緊手柄以將其固定。確保安全閥的重量放置正確，關(guān)閉排氣旋塞，設(shè)定定時器，然后開始加熱。

  隨著設(shè)備內(nèi)部溫度逐漸升高，蒸汽會從排氣軟管中冒出，但一段時間后閥門會自動關(guān)閉，內(nèi)部壓力會增加。若有蒸汽泄漏，將蓋子稍微擰緊，若仍不停止，則停止操作。運(yùn)行中請勿移動設(shè)備，若安全閥的重物因振動而脫落，請用鑷子等夾起重物，重新放置。

  經(jīng)過設(shè)定時間后，溫度和內(nèi)部壓力逐漸降低，在100℃左右排氣閥打開。當(dāng)壓力達(dá)到常壓且溫度降至100℃以下時，打開蓋子，取出儀器和試劑，直至其冷卻到可以容納的程度。

  用于精確測量少量量的微量移液器吸頭應(yīng)在使用前在高壓滅菌器中消毒并干燥。

  通過高壓滅菌對液體進(jìn)行滅菌時

  將液體放入玻璃容器中并進(jìn)行高壓滅菌。此時，您可以在打開（松開）蓋子的情況下進(jìn)行操作，也可以在關(guān)閉蓋子的情況下進(jìn)行操作。

  如果蓋子打開，任何普通耐熱玻璃容器都可以使用，但存在污染樣品的潛在風(fēng)險，以及揮發(fā)性物質(zhì)（鹽酸、乙酸、氨、碳酸、缺點(diǎn)是一些鹽（例如，鹽）通過蒸發(fā)而損失。如果用鋁箔蓋住容器的蓋子，加熱后即可關(guān)閉，無需直接接觸蓋子。如果在瓶子很熱時蓋上蓋子，瓶子內(nèi)部會形成負(fù)壓，蓋子將無法打開，因此請?jiān)谏w上蓋子之前讓其充分冷卻。

  液體培養(yǎng)基的滅菌也在開放系統(tǒng)中完成。蓋子使用鋁箔、硅膠泡沫塞、棉塞以及試劑瓶上的活蓋?；旧?，按照與普通溶液相同的方式進(jìn)行，高壓滅菌后，確保蓋子蓋緊，然后存放在陰涼、黑暗的地方。

  對瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌時，添加粉末狀的瓊脂，然后將瓊脂溶解在高壓滅菌器中。高壓滅菌后，濃稠的瓊脂溶液會沉淀在底部，因此用手搖晃使其均勻。一旦容器冷卻至 45-55°C，根據(jù)需要無菌添加不耐熱添加劑（抗生素、IPTG 等）和高壓滅菌后添加的鹽（鎂鹽、鈣鹽、磷酸鹽等）。如果不立即使用，請?jiān)?45-55°C 下保溫。

  對容器進(jìn)行高壓滅菌時，請務(wù)必使用壓力瓶。帶藍(lán)色瓶蓋（或同等瓶蓋）的杜蘭德瓶是不錯的選擇。但如果大于1升，則需要小心，因?yàn)樗苋菀讚p壞。向瓶子中添加的液體不要超過規(guī)定量，添加碳酸氫鈉時，將液體量限制在瓶子的一半左右。

  對溶液進(jìn)行高壓滅菌時，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)，防止發(fā)生事故。首先，不要向鍋中注入超過其容量35%的液體。鍋在操作過程中可能會爆炸。另外，高壓滅菌后，不要強(qiáng)行排氣，讓壓力和溫度自然下降，待充分冷卻后再取出。當(dāng)溶液溫度超過100℃時，如果打開、關(guān)閉蓋子或振動，可能會發(fā)生暴沸。特別是如果含有瓊脂，則很難冷卻，更容易發(fā)生這種事故。

  火焰滅菌

  使用煤氣燃燒器、酒精燈或電燃燒器，通過火焰加熱，灰化并分解設(shè)備表面的有機(jī)物。這種滅菌方法對無菌操作期間可能粘附在手、物體或接觸空氣的區(qū)域上的微生物進(jìn)行滅菌，對用于操縱細(xì)菌的鉑環(huán)和鉑絲尖端進(jìn)行滅菌，并使用不含 RNase 的抹刀和鑷子。它用于諸如建立國家等目的。它主要用于金屬消毒，但也可用于玻璃和聚四氟乙烯。

  火焰頂部溫度高（氧化焰），底部溫度低（還原焰），所以進(jìn)行火焰滅菌時，采用頂部氧化焰。

  請注意，如果在消毒酒精蒸發(fā)之前噴灑消毒酒精并進(jìn)行火焰消毒，可能會引起火災(zāi)。另外，小心不要因接觸火焰滅菌區(qū)域而被燒傷，或?qū)嵋埔汗懿迦爰?xì)胞懸浮液而損壞細(xì)胞。

  過濾除菌（過濾除菌）

  過濾滅菌適用于少量液體、不耐熱溶液、生物聚合物和有機(jī)溶劑的滅菌。

  過濾材料包括尼龍、PVDF、PES和醋酸纖維素，根據(jù)用途和樣品根據(jù)親水性和有機(jī)物吸附性能進(jìn)行選擇。0.4至0.8μm的孔徑足以去除不溶性物質(zhì)，但如果要去除微生物，請使用0.22μm或更小的孔徑。另外，去除支原體時，需要使用孔徑為0.1μm的過濾器。

  過濾滅菌在超凈工作臺上進(jìn)行。使用注射器型時，首先將樣品吸入注射器中。此時，也吸入少量空氣。打開裝有過濾器的夾套，將注射器插入過濾器，利用活塞推出液體，過濾樣品。將濾液轉(zhuǎn)移至無菌容器中。當(dāng)所有液體被推出時，空氣留在末端，但當(dāng)空氣接觸到過濾器時，它會鎖定并且無法進(jìn)一步被推入。如果您可以進(jìn)一步推動，則表明過濾器存在泄漏，因此請嘗試使用新過濾器再次過濾。

  上面我們已經(jīng)解釋了四種滅菌操作。如果程序不正確或不小心，滅菌操作可能會導(dǎo)致污染和事故。當(dāng)你反復(fù)做、習(xí)慣了之后，特別容易失敗，所以一定要記住初衷，認(rèn)真做。