ELISA結(jié)果 - 定量、定性和靈敏度

在ELISA試劑盒測(cè)定產(chǎn)生三種不同類(lèi)型的數(shù)據(jù)輸出：

定量

可以通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)曲線（已知純化抗原的連續(xù)稀釋?zhuān)┻M(jìn)行比較來(lái)解釋 ELISA 數(shù)據(jù)，以便精確計(jì)算各種樣品中抗原的濃度（圖 1）。

定性

ELISA 還可用于獲得“是”或“否”的答案，表明與不含抗原或不相關(guān)對(duì)照抗原的空白孔相比，樣品中是否存在特定抗原。

半定量

ELISA 可用于比較測(cè)定樣品中抗原的相對(duì)水平，因?yàn)樾盘?hào)強(qiáng)度將直接隨抗原濃度變化。

標(biāo)準(zhǔn)曲線

ELISA 數(shù)據(jù)通常用光密度與對(duì)數(shù)濃度作圖，以生成 S 形曲線，如圖 1 所示。已知濃度的抗原用于生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后通過(guò)與已知濃度的抗原進(jìn)行比較，使用該數(shù)據(jù)來(lái)測(cè)量未知樣品的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。這可以直接在圖表上完成，也可以使用 ELISA 讀板機(jī)上常見(jiàn)的曲線擬合軟件來(lái)完成。

圖 1. 典型的 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)曲線。

校準(zhǔn)曲線模型

如果需要定量結(jié)果，最簡(jiǎn)單的方法是對(duì)三份標(biāo)準(zhǔn)讀數(shù)進(jìn)行平均，并扣除空白對(duì)照樣品的讀數(shù)。接下來(lái)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，找到最佳擬合線或至少繪制一條點(diǎn)對(duì)點(diǎn)曲線，以便可以確定樣品的濃度。在此階段需要調(diào)整任何稀釋度。這通常是可以進(jìn)行手動(dòng)計(jì)算的實(shí)際程度。

一種變體是使用半對(duì)數(shù)、對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)、對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)及其導(dǎo)數(shù)（4 或 5 參數(shù)邏輯模型）繪制數(shù)據(jù)。使用基于軟件/自動(dòng)化的解決方案可以考慮更復(fù)雜的繪圖方法。在軟件包中使用線性回歸增加了更多檢查的可能性；可以檢查 R2 值以確定總體擬合優(yōu)度。對(duì)于濃度與讀數(shù)之間呈線性關(guān)系的曲線部分，R2 值 >0.99 表示非常適合。然后可以通過(guò)使用該范圍內(nèi)的更多標(biāo)準(zhǔn)濃度來(lái)進(jìn)一步提高準(zhǔn)確性。

線性圖的一方面是它壓縮了標(biāo)準(zhǔn)曲線較低濃度上的數(shù)據(jù)點(diǎn)，從而使其成為最準(zhǔn)確的范圍（最有可能達(dá)到所需 R2 值的區(qū)域）。為了抵消這種壓縮，可以使用半對(duì)數(shù)圖表；這里，濃度值的對(duì)數(shù)（x 軸）相對(duì)于讀數(shù)（y 軸）繪制。該方法給出了 S 形數(shù)據(jù)曲線，將更多的數(shù)據(jù)點(diǎn)分布到更用戶(hù)友好的 S 形模式中。

對(duì)數(shù)/對(duì)數(shù)（濃度對(duì)數(shù)與讀數(shù)對(duì)數(shù)）繪圖類(lèi)型設(shè)法使更多數(shù)據(jù)曲線線性化。在此模型中，低到中標(biāo)準(zhǔn)濃度范圍通常是線性的，只有范圍的高端傾向于傾斜。 log/logit 及其導(dǎo)數(shù)（4 或 5 參數(shù)邏輯模型）更加復(fù)雜，需要更復(fù)雜的計(jì)算和最大值、最小值、EC50 和斜率值的估計(jì)。 5 參數(shù)模型還需要不對(duì)稱(chēng)值。

雖然這些校準(zhǔn)曲線模型可以提供改進(jìn)的性能，但一個(gè)好的起點(diǎn)是使用雙對(duì)數(shù)圖并檢查回收率（加標(biāo)樣品中的分析物回收率）?；蛘撸辽?/span>“反向擬合”標(biāo)準(zhǔn)曲線讀數(shù)值通常是“足夠好的”方法。最簡(jiǎn)單的檢查方法是反算校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)并檢查它們是否在標(biāo)稱(chēng)讀數(shù)值的 20% 范圍內(nèi)。需要注意的是，不要依賴(lài)“良好”的 R2 值并找到可為標(biāo)準(zhǔn)品提供最佳回收率值的校準(zhǔn)曲線模型。

ELISA 靈敏度

ELISA 是可用的最靈敏的免疫測(cè)定之一。 ELISA 的典型檢測(cè)范圍為 0.1 至 1 fmole 或 0.01 ng 至 0.1 ng，靈敏度取決于抗體-抗原相互作用的特定特征。此外，一些底物（例如產(chǎn)生增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光或熒光信號(hào)的底物）可用于改善結(jié)果。

如前所述，間接檢測(cè)會(huì)產(chǎn)生更高水平的信號(hào)，因此應(yīng)該更靈敏。然而，它也可能導(dǎo)致較高的背景信號(hào)，從而降低凈特定信號(hào)水平。

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