ELISA試劑盒背景值高？別怕！新手也能輕松搞定

  在科研實驗中，在進行ELISA試劑盒實驗過程，通常會遇到一些常見問題——ELISA高背景問題。高背景信號會降低 ELISA 的靈敏度和特異性，并影響結果的準確性。它可能導致假陽性結果，或掩蓋低濃度待測物的信號。因此，減少ELISA背景噪音有助于提高實驗的準確性，為了實驗準確性，下面通蔚生物為大家盤點一些影響因素，對于噪音困擾，你可以對照這些因素來試著解決。如果還未解決，也可以尋求我們在線技術顧問。

  因素一、洗滌不充分

  在ELISA實驗步驟中要涉及到洗滌，如果不充分的洗滌，會未結合的物質（例如非特異性結合的抗體或檢測試劑）殘留在微孔板孔中，它會增加背景噪音。如有必要，可以通過增加洗滌緩沖液中的鹽濃度來阻止非特異性結合相互作用。如果背景太高并且您懷疑洗滌步驟不充分，在適當的情況下向洗滌緩沖液中添加洗滌劑或蛋白質，或者在兩次洗滌之間浸泡幾分鐘。

  因素二、封閉問題

  在ELISA實驗步驟中涉及到封閉，封閉不充分可產生信號的抗體非特異結合的機會。這時，我們會用封閉緩沖液，封閉緩沖液的作用是用非特異性結合的不相關蛋白質（或多種蛋白質）浸泡板或微孔中的潛在結合位點（基本上是任何剩余的粘性點）。這隨后減少了信號產生抗體非特異性結合的機會。

  在實驗之后，你可能會發(fā)現背景較高，如果您懷疑是封閉不足，您可以嘗試使用更高濃度的封閉劑，或增加封閉時間。希望阻斷劑不會掩蓋抗體抗原上的結合位點。

  市面上的封閉劑分2種類型：蛋白質和非離子去垢劑。具體使用哪種類型取決于許多因素，包括板的表面化學、吸附在其上的抗原、抗體和檢測試劑。

  最常見的非離子洗滌劑阻滯劑是Tween-20。去垢劑阻滯劑價格便宜、穩(wěn)定，并且可用于去除洗滌步驟中的一些非特異性結合。它的缺勢是它們很容易被洗掉。因此，所有洗滌溶液中也必須添加洗滌劑阻滯劑。注意不要使用高濃度（正常濃度約為0.01-0.1%），這會減少特異性結合并產生假陰性。另一種選擇是同時使用蛋白質和非離子洗滌劑阻滯劑，后者可以在洗滌步驟中幫助阻滯。

  與洗滌劑不同，蛋白質阻滯劑是永久性的。它們與開放空間結合并封閉它們，并且還穩(wěn)定與微孔板結合的抗原分子。洗掉多余的封閉緩沖液后，蛋白質封閉劑仍然存在（與去污劑封閉劑不同）。常見的蛋白質阻滯劑包括牛血清白蛋白（BSA）、脫脂奶粉、普通全血清和魚明膠。對于主要的阻斷問題，使用全血清作為阻斷劑可能很有吸引力，因為血清成分固有的多樣性使其能夠有效阻斷許多不同類型的分子相互作用。然而，全血清的缺點是它會與檢測反應中常用的ProteinA和抗IgG抗體發(fā)生交叉反應。解決這個缺點的一個方法是使用來自雞或魚的完整正常血清。

  其實封閉是ELISA實驗比較關鍵的一個步驟，大家在做實驗時，可以查看你具體使用的封閉試劑，在實驗過程持續(xù)優(yōu)化。

  問題三、抗體濃度過高或低

  抗體濃度過高會增加非特異性結合，抗體濃度過低會降低檢測靈敏度。大家在進行ELISA實驗之前，可以參考劑盒說明書，商業(yè) ELISA 試劑盒通常會提供建議的抗體濃度范圍，可以作為參考。

  問題四、檢測試劑不合理

  在ELISA實驗過程，檢測試劑使用合理非常重要！使用濃度過高或稀釋不當，可能會導致背景較高。不要使用檢測試劑過度顯色-如有必要，優(yōu)化何時使用終止液。

  上述是ELISA實驗中背景過高因素及問題優(yōu)化辦法，其實背景問題不要過于擔心，在實驗過程多總結多嘗試這些問題后續(xù)也會消失！如果在使用ELISA試劑盒遇到問題，也可以和我們在線顧問尋求幫助！