【通蔚生物】：禽肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)及使用方法

通蔚生物禽肺病毒染料法熒光定量RT-PCR試劑盒產(chǎn)品特點(diǎn)及使用方法如下：

產(chǎn)品及特點(diǎn)：
禽肺病毒(AvianPneumovirus，APV)會(huì)引起禽肺病毒感染，雞和火雞是本病的自然宿主，雉雞、珍珠雞和鵪鶉可被感染。該病毒主要經(jīng)接觸傳播，病禽及康復(fù)禽是主要傳染源。幼齡雞感染后臨床癥狀：氣管鑼音，打噴嚏，流鼻液，泡沫性結(jié)膜炎，眶下竇腫脹和頸下水腫，嚴(yán)重者咳嗽、甩頭。蛋雞感染后臨床癥狀：種雞和產(chǎn)蛋雞通常在產(chǎn)蛋高峰期發(fā)病，產(chǎn)蛋量下降5%-30%，有時(shí)下降70%，嚴(yán)重者導(dǎo)致輸卵管的脫垂；雞蛋皮薄、粗糙，種蛋孵化率降低。該病毒對(duì)養(yǎng)雞業(yè)會(huì)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，因此靈敏快捷的診斷產(chǎn)品具有重要的意義。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā)。
1.一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對(duì)照。
2.根據(jù)禽肺病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性。
3.基于染料法qRT-PCR檢測(cè)，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
4.使用一管式qRT-PCR技術(shù)，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品，降低了操作誤差和可能的污染。
5.本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR。
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
陽(yáng)性對(duì)照需要因易污染其他成分需要單獨(dú)放置。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
自備試劑：
樣品RNA。
使用方法：
一、稀釋陽(yáng)性對(duì)照：
以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例，由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7，6，5，4，3，2。用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同)。
2.在7號(hào)管中加入5μL1×10E8拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
3.換槍頭，在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
5.如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC(樣品制備陽(yáng)性對(duì)照)，一個(gè)是NC(樣品制備陰性對(duì)照)?？梢杂?0μL上步制備的陽(yáng)性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)(濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝)再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照(加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求)。可以用水作為制備的陰性對(duì)照。
6.用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
7.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照(用水做模板)，1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照(用第4號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板)。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè)，其余不變。
8.在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后最后加)：
注：需使用ROX染料I的機(jī)型：ABIPrism7000、7300、7700、7900HT、Step-One、Step-OnePlus。
需使用ROX染料II的機(jī)型：ABIPrism7500、7500Fast、MJResearch的Chromo4、Opticon(II)CorbettRotorGene3000。
不需要使用ROX的機(jī)型：ThermalCycleDiceRealTimeSystem，LightCycler、SmartCyclerSystem、AgilentMx3000P、RotorGene3000、RotorGene6000。
9.上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR(參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化)。
四、數(shù)據(jù)處理：
10.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
11.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
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