產(chǎn)品及特點:
糞腸球菌(Enterococcus faecalis)是革蘭氏陽性,過氧化氫陰性球菌, 是人和動物腸道內(nèi)主要菌群之一,其能產(chǎn)生天然抗生素,有利于機體健康;同時還能產(chǎn)生細菌素等抑菌物質(zhì),抑制大腸桿菌和沙門氏菌等病原菌的生長,改善腸道微環(huán)境;還能抑制腸道內(nèi)產(chǎn)尿素酶細菌和腐敗菌的繁殖,減少腸道尿素酶和內(nèi)毒素的含量,使血液中氨和內(nèi)毒素的含量下降。糞腸球菌作為一種益生菌,在醫(yī)學(xué)和食品工程領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。
另外,腸球菌為消化道內(nèi)正常存在的一類微生物,在腸黏膜具有較強的耐受和定植能力,并且是一種兼性厭氧的乳酸菌,與厭氧、培養(yǎng)保存條件苛刻的雙歧桿菌相比,更適合于生產(chǎn)和應(yīng)用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測糞腸球菌型的試劑盒。
1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,靈敏性高。
3. 提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高,引物是根據(jù)糞腸球菌高度保守區(qū)設(shè)計,不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分:
編號
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×Probe qPCR MagicMix
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500μL(本色蓋)
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試劑三
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL(黃蓋)
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試劑二
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糞腸球菌qPCR引物混合液
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100μL(白蓋)
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試劑四
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糞腸球菌qPCR探針
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50μL(棕色管)
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試劑五
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糞腸球菌qPCR陽性對照照(1×10E8/μL)
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50μL(紅蓋)
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使用手冊
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1份
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運輸及保存:
低溫運輸,-20℃保存,保存期限為 12 個月。
自備試劑:
樣品DNA。
使用方法:
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例):
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備:
7. 如果有 N 個樣品,最好設(shè)置 N+2 個提取,多出的一個是 PC(樣品制備陽性對照),一個是 NC(樣品制備陰性對照)??梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA,本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進行):
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復(fù),則標(biāo)記 N+4 個 PCR管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于 PCR 陽性對照(用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加):
成份
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N+2個樣品管
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PCR陰性對照管
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標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管2-7管
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2×Probe qPCR MagicMix
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10μL
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10μL
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各10μL
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糞腸球菌qPCR探針
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1μL
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1μL
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各1μL
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糞腸球菌qPCR引物混合液
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2個待測DNA模板
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7μL
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超純水
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7μL
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第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7號)
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各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
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11. 蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行PCR:
過程
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溫度
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時間
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預(yù)變性
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95℃
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3 min
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PCR反應(yīng)40個循環(huán)
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95℃
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15 sec
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60℃
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1 min(采集FAM通道的熒光信號)
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四、數(shù)據(jù)處理:
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值,再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40,擴增曲線有明顯起峰,該樣本判斷為陽性,否則為陰性。
五、特別提示:
本公司的所有產(chǎn)品,僅可用于科研實驗,嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途!